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Differenzierung
probiotischer Bakterien
Schriftenreihe, Heft 26/2011

Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 2
Differenzierung von probiotischen und
ubiquitären Milchsäurebakterien und
aeroben Sporenbildnern aus Futtermitteln
mittels FTIR-Spektroskopie
Dr. Mareike Wenning, Prof. Dr. Siegfried Scherer, Dr. Henriette Mietke-Hofmann

Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 3
Inhaltsverzeichnis
1
Zusammenfassung.................................................................................................................................................. 6
2
Einleitung.................................................................................................................................................................7
2.1
Problemstellung und Zielsetzung............................................................................................................................... 7
2.2
Einführung in die FTIR-Spektroskopie ....................................................................................................................... 7
2.3
Klassifizierung von FTIR-Spektren............................................................................................................................. 10
2.3.1
Distanzwerte basierend auf dem Pearson’s product moment correlation coefficient................................................. 10
2.3.2
Künstliche neuronale Netze ....................................................................................................................................... 11
2.4
Klassische und molekularbiologische Referenzmethoden......................................................................................... 12
2.4.1
Artidentifizierung ........................................................................................................................................................ 12
2.4.2
Stammtypisierung ...................................................................................................................................................... 12
3
Ergebnisse und Diskussion.................................................................................................................................... 13
3.1
Aerobe Sporenbildner................................................................................................................................................ 13
3.1.1
Referenzstämme........................................................................................................................................................ 13
3.1.2
Identifizierung auf Artebene....................................................................................................................................... 14
3.1.3
Differenzierung und Identifizierung auf Stammebene ................................................................................................ 14
3.1.3.1
Charakterisierung mittels API.....................................................................................................................................15
3.1.3.2
Typisierung über RAPD ............................................................................................................................................. 16
3.1.3.3
Typisierung und Identifizierung mittels FTIR-Spektroskopie ...................................................................................... 18
3.2
Milchsäurebakterien................................................................................................................................................... 23
3.2.1
Referenzstämme........................................................................................................................................................ 23
3.2.2
Identifizierung auf Artebene....................................................................................................................................... 23
3.2.3
Differenzierung und Identifizierung auf Stammebene ................................................................................................ 26
3.2.3.1
Charakterisierung mittels API.....................................................................................................................................26
3.2.3.2
Typisierung über RAPD ............................................................................................................................................. 27
3.2.3.3
Typisierung und Identifizierung mittels FTIR-Spektroskopie ...................................................................................... 27
4
Fazit...........................................................................................................................................................................31
5
Literaturverzeichnis................................................................................................................................................. 32

Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 4
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1:
FTIR-Spektren von
Bacillus
licheniformis
und
Bacillus subtilis
...............................................................................9
Abbildung 2:
Hitreport der OPUS-Datenbank für ein
Bacillus licheniformis
-Isolat. ....................................................................10
Abbildung 3:
Hitreport der OPUS-Datenbank für ein
Enterococcus faecium
-Isolat. ..................................................................11
Abbildung 4:
Schematische Darstellung eines hierarchisch strukturierten KNN........................................................................11
Abbildung 5:
Ergebnisreport eines KNN für ein
Enterococcus faecium
-Isolat. ..........................................................................12
Abbildung 6:
Kulturmorphologische Ausprägung des Präparats Bioplus 2B auf Tryptose-Agar................................................13
Abbildung 7:
Vergleich der API 50 CHB-Profile für
B. licheniformis
aus AlCare und Bioplus 2B nach 48 h Inkubation.............15
Abbildung 8:
RAPD Fragmentmuster stellvertretender Isolate der Präparate Bioplus 2B, Calsporin und AlCare......................17
Abbildung 9:
RAPD-Fragmentmuster stellvertretender Isolate der Präparate Bioplus 2B und GalliPro.....................................17
Abbildung 10: Clusteranalyse der FTIR-Spektren für
B. licheniformis
aus AlCare und Bioplus 2B. ............................................18
Abbildung 11: Clusteranalyse der FTIR-Spektren für
B. subtilis
aus Calsporin (rot und orange) und Bioplus 2B (blau). ............19
Abbildung 12: Clusteranalyse der FTIR-Spektren für
B. subtilis
aus Calsporin und Bioplus 2B. .................................................20
Abbildung 13: Hitliste für ein FTIR-Spektrum von
B. subtilis
aus Bioplus 2B...............................................................................21
Abbildung 14: RAPD Fragmentmuster stellvertretender Isolate der Präparate Bioplus 2B, Calsporin und AlCare sowie
einiger bereits in der Datenbank enthaltener Stämme..........................................................................................22
Abbildung 15: Architektur des KNN zur Identifizierung von Milchsäurebakterien vor der Erweiterung. .......................................24
Abbildung 16: Architektur des KNN zur Identifizierung von Milchsäurebakterien nach der Erweiterung mit neuen
Stämmen der Arten
E. faecium
und
P. acidilactici
................................................................................................25
Abbildung 17: API 50 CHL Profile der probiotischen Milchsäurebakterien sowie der beiden offiziellen
L. rhamnosus
-Stämme
DSM 20021 (T = Typstamm) und DSM 20177......................................................................................................26
Abbildung 18: RAPD Fragmentmuster stellvertretender Isolate der
E. faecium
-Stämme............................................................27
Abbildung 19: Clusteranalyse der FTIR-Spektren für die fünf probiotischen
E. faecium
-Stämme...............................................28
Abbildung 20: Vergleich der ersten Ableitungen von FTIR-Spektren vier probiotischer E. faecium-Isolate.................................29
Abbildung 21: Architektur des KNN zur Differenzierung von probiotischen und ubiquitären
E. faecium
-Stämmen. ....................30
Abbildung 22: Clusteranalyse der FTIR-Spektren für den probiotischen
L. rhamnosus
-Stamm DSM 7133 sowie
ubiquitäre Stämme und zwei weitere Stämme der DSM.......................................................................................30

Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 5
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1:
Übersicht über die zur Verfügung stehenden
Referenzisolate aus Futtermitteln mit probiotischem Zusatz. ........13
Tabelle 2:
Unterschiede der
B. subtilis
-Stämme aus Bioplus 2B, GalliPro und Calsporin in den API 50 CHB-Profilen.........15
Tabelle 3:
Übersicht über die Zahl der in den Futtermittelzusätzen enthaltenen Einzelstämme............................................18
Tabelle 4:
Zuverlässigkeit der angepassten FTIR-Referenzdatenbank für die Identifizierung von Stämmen aus
Bioplus 2B, Calsporin und GalliPro auf Art- und Stammebene sowie für die Typisierung nach
koloniemorphologischem und RAPD-Typ in Prozent. ...........................................................................................22
Tabelle 5:
Identifizierung der fünf probiotischen
E. faecium
-Stämme auf Artebene. .............................................................26
Tabelle 6:
Zahl der
E. faecium
-Isolate, die zum Training und zur Validierung des KNN zur Differenzierung
ubiquitärer von probiotischen Stämmen eingesetzt wurden..................................................................................29

Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 6
1 Zusammenfassung
Die Identifizierung probiotischer Futtermittelzusätze im Rahmen der mikrobiologischen Qualitätsbewertung von Futtermitteln ist
von hoher Bedeutung für eine korrekte Interpretation der Ergebnisse, stellt jedoch hohe Anforderungen an die
Analysenmethode hinsichtlich Zuverlässigkeit, Reproduzierbarkeit und Arbeitsaufwand. Fourier-transform Infrarot (FTIR)-
Spektroskopie wurde in diesem Zusammenhang bereits erfolgreich für die Identifizierung probiotischer Stämme von
Saccharomyces cerevisiae
und
Bacillus cereus
eingesetzt und sollte im vorliegenden Projekt für die Anwendung auf weitere
Bacillus
-Arten und Milchsäurebakterien adaptiert werden. Dabei sollte zunächst eine Differenzierung zwischen eingesetzten
Probiotika und ubiquitär vorkommenden Vertretern der jeweiligen Arten etabliert und im Folgenden zwischen einzelnen
probiotischen Stämmen der gleichen Art unterschieden werden. Als Referenzmethoden für die Artidentifizierung und
Stammtypisierung dienten 16S rDNA-Sequenzierung und RAPD-PCR; der Einsatz des API-Systems wurde ebenfalls getestet.
Sowohl für die Bazillen als auch die Milchsäurebakterien bestanden an der Abteilung Mikrobiologie der Technischen Universität
München bereits umfangreiche Referenzdatenbanken für die Artidentifizierung, die nun mit Futtermittelisolaten erweitert und für
die Stammtypisierung angepasst wurden. Für die Erstellung der Datenbanken wurden zwei unterschiedliche Softwaresysteme
verwendet, von denen eines in die Spektrometersoftware OPUS integriert war und ein weiteres eine separate Software für die
Erstellung künstlicher neuronaler Netze darstellte.
Bei den Sporenbildnern wurden insgesamt die vier Futtermittelzusätze Bioplus 2B, Calsporin, AlCare und GalliPro verwendet,
die entweder als Ein- oder Mehrstammkultur
Bacillus licheniformis
und/oder
Bacillus subtilis
enthielten. Die
molekularbiologische Typisierung ergab, dass sich die einzelnen Stämme meist gut voneinander differenzieren ließen, nur die
B. subtilis
-Isolate aus Bioplus 2B und GalliPro zeigten identische Muster. Auch mit FTIR-Spektroskopie war eine Differenzierung
gut möglich, jedoch zeigten auch hier die
B. subtilis
-Isolate aus Bioplus 2B und GalliPro keine Unterschiede und konnten somit
durch keine der eingesetzten Methoden differenziert werden. Aus diesem Grund wurden sie bei der Bewertung der
Zuverlässigkeit der FTIR-Spektroskopie für die Stammtypisierung als ein Stamm behandelt. Die adaptierte Datenbank lieferte
hervorragende Ergebnisse sowohl für die Unterscheidung probiotischer und ubiquitärer Stämme als auch für die Differenzierung
einzelner Probiotika und erzielte Identifizierungsergebnisse mit einer Zuverlässigkeit zwischen 91 und 100 %.
Bei den Milchsäurebakterien wurden die drei Arten
Enterococcus faecium
,
Lactobacillus rhamnosus
und
Pediococcus
acidilactici
untersucht. Weil für
P. acidilactici
nur das probiotische Isolat, jedoch keine Umweltisolate zur Verfügung standen,
wurde lediglich das vorhandene Isolat in die Datenbank integriert. Von
L. rhamnosus
stand ein Stamm zur Verfügung, von
E. faecium
fünf unterschiedliche Stämme. Folglich wurde für
L. rhamnosus
die Differenzierung des probiotischen Stamms von
Umweltisolaten etabliert, für
E. faecium
zusätzlich die Unterscheidung der einzelnen Probiotika. Wie schon bei den
Sporenbildnern gab es hier zwei Isolate, die weder mit RAPD-PCR noch über ihre FTIR-Spektren differenziert werden konnten
und somit in der Referenzdatenbank als identisch behandelt wurden. Die etablierten Datenbanksysteme für die Typisierung der
Milchsäurebakterien wiesen eine sehr hohe Leistungsfähigkeit auf und konnten unbekannte Spektren mit einer Zuverlässigkeit
von 98 bis 100 % dem korrekten Stamm zuordnen.
Somit steht mit der FTIR-Spektroskopie eine genaue und einfach anzuwendende Methode für die Analyse von
Mikroorganismen in der Futtermittelmikrobiolgie zur Verfügung, wobei die Technik sowohl für Artidentifizierungen als auch
Stammtypisierungen genutzt werden kann. Die etablierten Datenbanken sind bereits auf viele Futtermittelzusätze angepasst
und können bei Bedarf auch mit zusätzlichen Stämmen erweitert werden.

Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 7
2 Einleitung
2.1 Problemstellung und Zielsetzung
Aerobe Sporenbildner werden bei der mikrobiologischen Untersuchung von Futtermitteln generell als verderbanzeigende
Bakterien angesprochen und neben Staphylokokken und Mikrobkokken in einer eigenen Keimgruppe erfasst.
Milchsäurebakterien hingegen spielen quantitativ in trockenen Futtermitteln pflanzlichen oder tierischen Ursprungs zumeist
keine Rolle. Sie werden wegen ihrer größtenteils negativen Reduktion von Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) und ihrer
negativen Katalasereaktion nicht mit erfasst (VDLUFA Methodenbuch III). Ein erhöhtes Auftreten von Milchsäurebakterien
(> 10
4
KBE/g) in einem trockenen Futtermittel ist somit immer ein Hinweis auf einen probiotischen Zusatz, es sei denn, das
Produkt hat eine feuchte Produktionsphase durchschritten, in der Milchsäurebakterien am Abbau leichtverdaulicher
Kohlenhydrate beteiligt waren, wie z. B. Malzkeime (M
IETKE-HOFMANN et al. 2008). In Flüssigfuttermitteln und
Vergärungsprodukten stellen Milchsäurebakterien allerdings die dominierende Keimgruppe dar.
Problematisch sind demnach hohe Gehalte aerober Sporenbildner in Produkten, die laut Deklaration keinen probiotischen
Zusatz enthalten, weil dies hier ein Indiz für schlechte mikrobiologische Qualität ist. Dennoch können auch solche Produkte
über Verschleppungen im Mischfutterwerk, fälschlichen Zusatz oder eine unterlassene Deklaration probiotische Organismen
enthalten, deren Identität jedoch nur über eine exakte Bestimmung der Spezies und des Stamms ermittelt werden kann. Über
die Artidentifizierung wird bestimmt, ob es sich prinzipiell um ein Probiotikum handeln könnte, weil nur wenige Arten überhaupt
als Futtermittelzusätze eingesetzt werden. Handelt es sich um eine andere Art, sind die detektierten Organismen als
qualitätsmindernd einzustufen. Wird bei der Identifizierung jedoch eine Spezies ermittelt, die auch als Probiotikum Verwendung
findet, muss geprüft werden, ob es sich um einen zugelassenen probiotischen Stamm oder ein Umweltisolat handelt.
Diese Differenzierung ist jedoch keineswegs trivial, weil hinreichend spezifische und dennoch robust zu bestimmende Merkmale
meist nur molekularbiologisch ermittelt werden können, was in der Regel mit entsprechend hohem Aufwand verbunden ist.
Wünschenswert wäre hingegen eine Technik, die sich einfach und mit überschaubarem Arbeits- und Kostenaufwand anwenden
lässt und dennoch zuverlässige Ergebnisse liefert. Für die Differenzierung probiotischer Hefen der Spezies
Saccharomyces
cerevisiae
und Bazillen der Art
Bacillus cereus
wurde in diesem Zusammenhang FTIR-Spektroskopie erfolgreich eingesetzt
(S
CHLEIF & MIETKE 2003; BÜCHL et al. 2010; MIETKE et al. 2010; BÜCHL et al. 2011) und sollte im Rahmen des vorliegenden
Projektes für die Differenzierung weiterer probiotischer Futtermittelzusätze getestet werden. Das Forschungsprojekt war dabei
in zwei Teilprojekte untergliedert. Gegenstand des ersten Teils waren aerobe Sporenbildner der Gattung
Bacillus
, des zweiten
Teils Milchsäurebakterien der Gattungen
Enterococcus
und
Lactobacillus
. Ziel beider Projekteile war es zum einen, die
Identifizierung der betreffenden Organismen auf Artebene mit FTIR-Spektroskopie sicherzustellen und zum anderen die
Differenzierung ubiquitärer Stämme und probiotischer Organismen aus Futtermittelzusätzen ebenfalls auf Basis der FTIR-
Spektroskopie zu entwickeln.
Zu klären war in diesem Zusammenhang zudem die Frage, ob eine Erweiterung der bereits vorhandenen FTIR-
Referenzdatenbank zur Identifizierung aerober Sporenbildner mit Isolaten aus Futtermitteln ausreicht, um einen zuverlässigen
Einsatz dieser Technik in der Futtermittelmikrobiologie zu sichern, oder ob eine Umstellung der Datenauswertung auf künstliche
neuronale Netze (KNN) erforderlich ist. Weil für die Identifizierung von Milchsäurebakterien bereits ein KNN bestand, wurde
dieses mit Isolaten aus Futtermitteln erweitert und um die Stammdifferenzierung ergänzt.
2.2 Einführung in die FTIR-Spektroskopie
Mikroorganismen unterscheiden sich nicht nur genetisch oder anhand unterschiedlicher Fähigkeiten zur Verwertung von
Nährstoffen, sondern auch in ihrer ganzen Zellzusammensetzung. So können Art und Menge der Polysaccharide, Proteine oder
Fettsäuren in den unterschiedlichen Bausteinen der Zellen variieren und weil jeder Zellbaustein infrarotes Licht spezifisch
absorbiert, lässt sich mit Fourier-transform Infrarot (FTIR)-Spektroskopie die Zusammensetzung der Zellen als biochemischer
Fingerabdruck erfassen. Die gemessenen Spektren sind dabei so charakteristisch, dass sie für Identifizierungszwecke genutzt

Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 8
werden können. In Abbildung 1 [A] sind beispielhaft einige FTIR-Spektren von
Bacillus
licheniformis
und
Bacillus subtilis
dargestellt. Sie zeigen markante Peaks, die in den meisten Fällen konkreten Stoffklassen zugeordnet werden können. Die
einzelnen Peaks bestehen aus vielen sich überlagernden Absorptionen, die über die Berechnung der ersten oder zweiten
Ableitung der Originalspektren aufgelöst werden (Abbildung 1 [B]). In der Vergrößerung zeigt sich, dass die Spektren
unterschiedlicher
Arten (hier
B. licheniformis
und
B. subtilis
) eindeutige Unterschiede aufweisen, anhand derer sie gut zu
differenzieren sind (Abbildung 1 [C]). Weil die Zellen der Organismen für die Messung nicht zerstört, sondern in intaktem
Zustand
präpariert werden, umfasst die Probenpräparation nur einige wenige Schritte, die im wesentlichen die standardisierte
Kultur der Organismen, deren Ernte vom Inkubationsmedium und die Antrocknung auf einem Probenträger beinhalten.
Prinzipiell gibt es unterschiedliche Methoden der Probenpräparation (W
ENNING et al. 2008), wobei jedoch die Kultivierung der
Organismen auf festen Medien aufgrund des geringeren Arbeitsaufwands zu bevorzugen ist.
Bei der Messung in Transmission durchströmt infrarotes Licht die getrockneten Zellen und alle in der Zelle vorhandenen
Moleküle werden über ihre spezifische Absorption des IR-Lichts quantitativ erfasst. Das Resultat sind hochspezifische
Fingerprints, die sich nicht nur für eine Artidentifizierung eignen, sondern auch auf Stammebene typisiert werden können.
Allerdings geht die sehr hohe Spezifität mit einer erhöhten Sensitivität gegenüber Änderungen am Präparationsprotokoll einher,
weil Abweichungen in den Wachstumsbedingungen (z. B. Art des Mediums, Inkubationstemperatur oder -dauer) zu einer
veränderten Zellzusammensetzung der Organismen führen, die sich in der Folge auch in veränderten Spektren niederschlägt
und unter Umständen die Identifizierung beeinträchtigen kann. Kleinere Abweichungen beeinträchtigen die Identifizierung
hingegen nicht (O
UST et al. 2004a) und bei strikt standardisiertem Protokoll sind sehr zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.

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Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 9
Abbildung 1: FTIR-Spektren von
Bacillus licheniformis
und
Bacillus subtilis
(A) Originalspektren, (B) zweite Ableitungen, (C) vergrößerter Ausschnitt der Ableitungen, blau:
B. licheniformis
, rot:
B. subtilis
. Die schattierten Regionen der Spektren in (A) enthalten verwertbare Informationen. Die dominierenden
biochemischen Komponenten der jeweiligen Region sind oberhalb der Spektren angegeben.
Seit die FTIR-Spektroskopie Anfang der 1990er-Jahre von Dieter Naumann und seinen Mitarbeitern am Robert Koch-Institut als
Technik zur Identifizierung von Mikroorganismen eingeführt wurde (N
AUMANN et al. 1991), ist sie auf die unterschiedlichsten
Gruppen von Mikroorganismen und Fragestellungen angewandt worden. Viele Arbeiten beschäftigten sich mit der
Identifizierung oder Differenzierung bestimmter Arten und Gattungen, wobei sowohl Hefen (K
ÜMMERLE et al. 1998; TIMMINS et al.
1998; T
INTELNOT et al. 2000; WENNING et al. 2002; ESSENDOUBI et al. 2005; BÜCHL et al. 2008) und Schimmel (FISCHER et al.
2006; N
AUMANN 2009; SHAPAVAL et al. 2010) als auch eine Reihe von Bakterien wie Staphylokokken (AMIALI et al. 2007), gram-
negative Bakterien (WINDER et al. 2004; MOUWEN et al. 2006; BOSCH et al. 2008; COUTINHO et al. 2009; KUHM et al. 2009),
Milchsäurebakterien (G
OODACRE et al. 1996; GUIBET et al. 2003; OUST et al. 2004b; WENNING et al. 2010), Clostridien (KIRKWOOD
et al. 2006), coryneforme Bakterien (O
BERREUTER et al. 2002; WENNING et al. 2006), Listerien (REBUFFO et al. 2006; OUST JANBU
et al. 2008; R
EBUFFO-SCHEER et al. 2008), Mycobakterien (REBUFFO-SCHEER et al. 2007a) oder Bazillen (BEATTIE et al. 1998) im
Fokus standen. Allen Arbeiten ist gemein, dass sie FTIR-Spektroskopie sehr erfolgreich und mit hoher Präzision auf die
Identifizierung der jeweiligen Organismen anwenden konnten und das Potenzial der Technik für die Artidentifizierung
eindrucksvoll belegen.

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Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 10
Neben der Artidentifizerung wurde FTIR-Spektroskopie auch bereits mehrfach zur Typisierung unterhalb des Speziesniveaus
eingesetzt. So zeigte sich, dass die Technik ein hohes Potenzial für die Serotypisierung hatte (H
ELM et al. 1991b; KIM et al.
2005; REBUFFO-SCHEER et al. 2007b) und sich auch zur Unterscheidung von Genotypen sehr gut eignete (SELTMANN et al. 1994;
S
ANDT et al. 2003; MOUWEN et al. 2006; MIETKE et.a. 2010; BÜCHL et al. 2010). In diesem Zusammenhang ist besonders die
Arbeit von B
ÜCHL et al. (2010) hervorzuheben, die ein Identifizierungssystem für fünf unterschiedliche
Saccharomyces
cerevisiae
-Stämme, die als probiotische Futtermittelzusätze dienen, erstellten. Das Klassifizierungssystem war zunächst darauf
ausgelegt, die fünf Futtermittelzusätze von ubiquitären Stämmen zu differenzieren und im Anschluss die fünf Probiotika
untereinander zu unterscheiden. Zwei dieser fünf Stämme konnten auch mit genetischen Methoden nicht differenziert werden,
weshalb sie im resultierenden System in einer Klasse zusammengefasst wurden; die übrigen Stämme ließen sich sowohl über
molekularbiologische Referenzmethoden als auch FTIR-Spektroskopie gut unterscheiden. Die Validierung der FTIR-Datenbank
ergab eine korrekte Zuordnungsrate von 98,2 % und demonstiert damit die sehr hohe Zuverlässigkeit der Methode.
2.3 Klassifizierung von FTIR-Spektren
Ein wesentlicher Schritt bei der Erstellung von Identifizerungssystemen mit FTIR-Spektroskopie ist die Art und Weise der
Datenauswertung und Klassifizierung von Spektren, weil diese einen sehr hohen Informationsgehalt haben, der zunächst auf
wesentliche Inhalte reduziert und dann so verarbeitet werden muss, dass eine zuverlässige Zuordnung unbekannter Spektren
zu den Referenzdaten erfolgt. Hierzu stehen eine ganze Reihe von statistischen Verfahren und Methoden zur Verfügung
(N
AUMANN 2000; MARIEY et al. 2001; JARVIS AND GOODACRE 2005; PREISNER et al. 2007; WENNING et al. 2008), von denen die
zwei in diesem Projekt verwendeten im Folgenden kurz erläutert werden sollen.
2.3.1
Distanzwerte basierend auf dem Pearson’s product moment correlation coefficient
Für die Zusammenstellung der Spektren zu Datenbanken und die Identifizierung unbekannter Spektren steht die zum
Spektrometer gehörende Software OPUS (Bruker Optik) zur Verfügung. Sie identifiziert unbekannte Spektren anhand von
Distanzwerten, die auf Basis des Pearson´s product moment correlation coefficient berechnet werden (H
ELM et al. 1991a), und
gibt das Ergebnis als Hitliste der ähnlichsten in der Referenzdatenbank enthalten Referenzspektren aus (Abbildung 2).
Abbildung 2: Hitreport der OPUS-Datenbank für ein
Bacillus licheniformis
-Isolat
Die Beurteilung der Hitliste erfolgt im Wesentlichen anhand der Reihenfolge der Artnamen; als zweites Kriterium dienen die
berechneten Distanzwerte, in der Hitliste als Hit Quality angegeben, die für eine akzeptable Identifizierung unter 1,5 liegen
sollten. Das in Abbildung 2 dargestellte Beispiel zeigt die Identifizierung eines
Bacillus
-Isolats, das anhand der Hitliste eindeutig
als
Bacillus licheniformis
identifiziert werden konnte. Weil für eine sichere Identifizierung nicht das komplette Spektrum, sondern
nur Teilbereiche verwendet werden, muss zuvor eine Auswahl der spektralen Fenster mit der höchsten Diskriminierungstiefe
getroffen werden. Bei der OPUS-Software wird dieser Schritt nicht von einem Algorithmus, sondern durch den Nutzer
ausgeführt, wobei hier unterschiedliche Bereiche miteinander kombiniert werden und die optimale Fensterkombination
schrittweise erarbeitet wird (H
ELM et al. 1991a).
Die OPUS-Datenbanken sind einfach zu handhaben und zu erweitern, weil sie keine Kalibrierung enthalten, die bei jeder
Erweiterung aktualisiert werden müsste. Sie können somit auch von Nutzern bedient werden, die keine Erfahrung mit
statistischer Datenauswertung haben und sind aufgrunddessen auch gut für den Einsatz in Industrielaboren geeignet. Allerdings

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Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 11
stoßen die OPUS-Datenbanken bei der Differenzierung eng verwandter Arten oder Stämme an die Grenzen ihrer
Leistungsfähigkeit, weil die Berechnung eines einzigen Distanzwertes hier nicht diskriminativ genug ist. Verdeutlich wird dies in
Abbildung 3, die ein nicht eindeutig zu interpretierendes Identifizierungsergebnis für ein
Enterococcus
-Isolat darstellt. Es fällt
auf, dass die Hitliste eine Mischung unterschiedlicher Arten zeigt, die noch dazu alle sehr ähnliche Hit Qualities haben. Zwar
kann die Identifizierung auf die Gruppe hier ähnlicher Arten eingegrenzt werden, eine zuverlässige Identifizierung auf
Speziesniveau ist aber nicht möglich.
Abbildung 3: Hitreport der OPUS-Datenbank für ein
Enterococcus faecium
-Isolat
Um hier eine größere Differenzierungstiefe zu gewinnen, müssen Techniken eingesetzt werden, die nicht nur Unterschiede
zwischen Spektren erfassen, sondern auch berücksichtigen, in welchen spektralen Bereichen sich diese befinden. Bei großen
Datenbanken ist zudem oftmals auch die Erstellung eines Klassifizierungsbaumes hilfreich, bei dem die Identifizierung nicht in
einem Schritt erfolgt, sondern in mehrere aufeinanderfolgende Schritte unterteilt wird.
2.3.2
Künstliche neuronale Netze
Für die Lösung besonders komplexer Klassifizierungsprobleme eignen sich vor allem künstliche neuronale Netze (KNN)
(U
DELHOVEN et al. 2000; MAQUELIN et al. 2003; REBUFFO et al. 2006; BÜCHL et al. 2008; WENNING et al. 2010), die zu den
Systemen der künstlichen Intelligenz gehören und im Rahmen eines Trainingsprozesses (Kalibrierung) anhand eines
Referenzdatensatzes die Zuordnung von Daten zu vorgegebenen Klassen (z. B. Gattungen oder Arten) erlernen können.
Während des Trainings wird die Verarbeitung der Eingabedaten (Absorptionswerte) so optimiert, dass eine eindeutige und
korrekte Klassenzuweisung erfolgt. Zur Lösung komplexer Probleme wie der Differenzierung einer großen Zahl an Klassen
kann ein hierarchisch strukturierter Identifizierungsbaum erstellt werden, bei dem zunächst eine Differenzierung in größere
Gruppen und in der nächsten Ebene eine feinere Aufschlüsselung jeder Gruppe erfolgt (siehe Abbildung 4). Für die Erarbeitung
von KNN
zur Identifizierung von FTIR-Spektren existiert eine spezialisierte Software (NeuroDeveloper
®
) der Firma Synthon in
Heidelberg (U
DELHOVEN et al. 2003), die alle notwendigen Schritte und Methoden abdeckt und auch im Rahmen dieses
Projektes Verwendung fand.
Abbildung 4: Schematische Darstellung eines hierarchisch strukturierten KNN
Integriert in die Software ist auch ein Modul, das verschiedene Aspekte der Datenvorverarbeitung umfasst. So können z. B.
über Kovarianzanalyse die diskriminierendsten Wellenzahlen aus den Spektren extrahiert werden, womit sich das
Identifizierungsystem sehr präzise und spezifisch, aber dennoch nutzerfreundlich auf das Klassifizierungsproblem zuschneiden
lässt. Ein weiterer Vorteil dieser Art der Datenverarbeitung ist die Ausgabe des Ergebnisses, was nicht in Form einer Trefferliste
geschieht, sondern als die Klasse, zu der das unbekannte Spektrum aufgrund der Kalibrierung zugeordnet wird (Abbildung 5).

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Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 12
Hier muss keine Interpretation des Ergebnisses erfolgen, weil dieser Aspekt über die Datenverarbeitung abgedeckt ist. Ein
Nachteil der Methode ist hingegen, dass die Kalibrierung und Entwicklung der hierarchischen Architektur ein arbeitsaufwändiger
Prozess ist, der bei jeder Erweiterung des Systems erneut durchlaufen werden muss.
Abbildung 5: Ergebnisreport eines KNN für ein
Enterococcus faecium
-Isolat
2.4 Klassische und molekularbiologische Referenzmethoden
Unabdingbar für den Aufbau einer FTIR-Referenzdatenbank ist die eindeutige Identifizierung der als Referenzen verwendeten
Stämme, denn nur wenn hier korrekte Daten verwendet werden, kann eine Kalibrierung erfolgreich sein. Zu diesem Zweck
stehen unterschiedliche Methoden zur Verfügung, die auf der Erfassung phänotypischer oder genetischer Merkmale beruhen.
2.4.1 Artidentifizierung
Basis für die Artidentifizierung im vorliegenden Projekt war die partielle Sequenzierung des 16S rRNA Gens, eines Teils der
ribosomalen DNA, die nach wie vor der Goldstandard der Speziesidentifizierung ist. Sequenzdaten sind besonders zuverlässig,
weil sie sich im Laufe der Zeit nur marginal ändern und sich deshalb Verwandtschaftsverhältnisse einzelner Arten an ihnen
genau ablesen lassen. Zudem sind sie vollkommen unabhängig von der Art und Weise der Probenpräparation und lassen sich
mit einer vernächlassigbar kleinen Fehlerrate exakt bestimmen. Dies ermöglicht auch einen Vergleich von Daten aus
unterschiedlichen Laboren und hat zur Entstehung einer sehr umfassenden Datenbank im Internet geführt, anhand derer
unbekannte Sequenzen identifiziert werden können. Ein Nachteil der Methode ist allerdings, dass für die Bestimmung der DNA-
Sequenzen ein molekularbiologisches Labor zur Verfügung stehen und das Personal entsprechend geschult sein muss,
weshalb die Technik in vielen Laboren nicht etabliert ist.
Eine einfach anzuwendende und weit verbreitete Alternative zur Identifizierung von Mikroorganismen sind kommerziell
verfügbare Kits wie das API-System von bioMérieux. Hier wird die Verwertung einer ganzen Reihe an Nährstoffen, meist
Zuckern, getestet und anhand der erhaltenen Profile eine Zuordnung zu Spezies vorgenommen. Weil alle notwendigen
Reagenzien vom Hersteller bezogen werden, kann die Technik zwar in jedem Labor angewendet werden, die Ergebnisse sind
jedoch mit Unsicherheiten und Fehlern behaftet (S
AMPIMON et al. 2009; RIESER et al. submitted) und damit nur sehr
eingeschränkt zuverlässig. Maßgeblich hierfür ist die Tatsache, dass nur einzelne Merkmale bestimmt werden und Enzyme für
die Verwertung bestimmter Zucker je nach Anpassung eines Organismus an ein bestimmtes Habitat verloren gehen oder
hinzugewonnen werden können. Das so veränderte Profil der Zuckerverwertung ist dann unter Umständen nicht mehr arttypisch
und führt zu falschen Identifizierungen.
2.4.2 Stammtypisierung
Auch bei der Stammtypisierung sind molekularbiologische Methoden das Maß der Dinge; im vorliegenden Projekt wurde die
RAPD-PCR angewandt. Hier werden mit Hilfe von kurzen Primern, die an vielen Stellen im Genom binden können, DNA-
Fragmentmuster erzeugt, die aufgrund der zufallsbedingten Verteilung der Zielsequenzen stammtypisch sind. Die Technik ist
bei Vorhandensein eines molekularbiologischen Labors verhältnismäßig einfach durchzuführen und wurde bereits erfolgreich
auf die Typisierung von Bazillen und Milchsäurebakterien angewandt (R
ONIMUS et al. 1997; JURKOVIC et al. 2007;
M
AHENTHIRALINGAM et al. 2009). Allerdings sind RAPD-Ergebnisse nicht von einem Labor auf das andere übertragbar, weil die
Fragmentmuster sehr sensitiv auf Änderungen in der Durchführung reagieren, weshalb die Methode als laborübergreifende
Referenzmethode nicht geeignet ist.
Als zweite Methode zur Stammtypisierung wurde die phänotypische Chrakterisierung über API verwendet. Obwohl das System
eigentlich für die Artidentifizierung entwickelt wurde, können die ermittelten Enzymcharakteristika unter Umständen auch für
eine Typisierung genutzt werden. Jedoch muss bedacht werden, dass mit dem API 50 CH-System nur 50 Merkmale erfasst
werden und die Diskriminierungstiefe aufgrund dessen gering ist. Weil im vorliegenden Projekt jedoch nur wenige Stämme zu
differenzieren waren, wurde die Technik hier dennoch in Erwägung gezogen.

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Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 13
3 Ergebnisse und Diskussion
3.1 Aerobe Sporenbildner
3.1.1 Referenzstämme
Untersuchungsgegenstand des vorliegenden Projekts waren die probiotischen
Bacillus
-Stämme aus den vier unterschiedlichen
Futtermittelzusätzen Bioplus 2B, Calsporin, AlCare und GalliPro. Eine Aufstellung der enthaltenen Spezies und der zur
Verfügung stehenden Isolate ist in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle
1: Übersicht über die zur Verfügung stehenden Referenzisolate aus Futtermitteln mit probiotischem Zusatz
Futtermittelzusatz
Enthaltene Spezies
Zahl der Referenzstämme
Bioplus 2B
B. licheniformis
B. subtilis
25
45
Calsporin
B. subtilis
58
AlCare
B. licheniformis
1
GalliPro
B. subtilis
44
Auffällig war, dass die
B. subtilis
-Isolate sowohl für Bioplus 2B als auch für Calsporin und GalliPro jeweils in zwei Morphotypen
zu unterteilen waren, weil sie unterschiedliche Koloniemorphologien ausbildeten. Abbildung 6 zeigt die Anzucht einer
Verdünnung
des Präparats Bioplus 2B auf PC-Agar. Drei unterschiedliche Kolonieformen können hier unterschieden werden,
wovon eine
B. licheniformis
zugeordnet werden kann, die beiden anderen
B. subtilis
.
Ein ähnliches Bild zeigte sich auch bei den
B. subtilis
-Isolaten aus Calsporin und GalliPro. Zur Differenzierung dieser
unterschiedlichen Morphologien wurden diese Isolate mit T für typisch und A für atypisch gekennzeichnet. Für Bioplus 2B waren
29 Isolate der typischen und 16 der atypischen Form zugeordnet, für Calsporin 22 der typischen und 10 der atypischen und bei
GalliPro jeweils 22 der typischen und atypischen Form. Bei 26 Isolaten von Calsporin wurde eine andere Einteilung nach
koloniemorphologischem Erscheinungsbild vorgenommen. Hier wurden die drei Morphologien glatt (typisch, 11 Isolate), runzlig
(atypisch, 10 Isolate) und flach/trocken (vier Isolate) unterschieden.
Abbildung 6: Kulturmorphologische Ausprägung des Präparats Bioplus 2B auf Tryptose-Agar
Grün:
B. licheniformis
, Blau:
B. subtilis
typische Form, Rot:
B. subtilis
atypische Form.

Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 14
3.1.2 Identifizierung auf Artebene
In der Abteilung Mikrobiologie des ZIEL Weihenstephan der Technischen Universität München existierte bereits eine
Referenzdatenbank für die Identifizierung aerober Sporenbildner, die insgesamt 402 Stämme aus 63 unterschiedlichen Arten
umfasste.
Die bestehende FTIR-Referenzdatenbank zur Identifizierung aerober Sporenbildner sollte zunächst auf ihre Leistungsfähigkeit
bei der Identifizierung probiotischer Stämme getestet und dann weiter auf diese Aufgabenstellung angepasst werden. Hierfür
wurde nur ein Teil der zur Verfügung stehenden Isolate genutzt; die übrigen Isolate sollten zum Test der adaptierten Datenbank
verwendet werden. Für eine erste Identifizierung wurden 17
B. licheniformis
- und 29
B. subtilis
-Isolate aus Bioplus 2B, das
einzige vorhandene
B. licheniformis
-Isolat aus AlCare und 32 Isolate von
B. subtilis
aus Calsporin genutzt. Für alle Organismen
wurden sieben unabhängige FTIR-Spektren aufgenommen und mit der bestehenden Datenbank identifiziert. Allein für das
Präparat GalliPro, das als letzter Futtermittelzusatz erst nach Abschluss der Datenbankanpassung mit allen übrigen
probiotischen Stämmen bearbeitet wurde, wurden alle vorhanden 44 Isolate analysiert. Hier wurden für jedes Isolat sechs
Spektren aufgenommen.
Alle
B. licheniformis
-Isolate wurden mit FTIR-Spektroskopie als
B. licheniformis
identifiziert; die Datenbank lieferte hier also
auch ohne eine Anpassung an Isolate aus Futtermitteln sehr gute Ergebnisse. Die
B. subtilis
-Isolate des Bioplus 2B-Produktes
hingegen wurden zunächst ebenfalls als
B. licheniformis
identifiziert und das, obwohl 50
B. subtilis
-Stämme als Referenzen in
der Datenbank hinterlegt waren. Da jedoch nicht alle Referenzstämme der Datenbank über molekularbiologische Techniken
identifiziert worden waren, bestand die Möglichkeit, dass einige Referenzspektren falsch benannt waren. Die Identität eines
Teils der in der Datenbank enthaltenen Stämme wurde mit 16S rDNA-Sequenzierung überprüft und es stellte sich heraus, dass
die Spektren von sieben Stämmen, die als
B. licheniformis
in der Datenbank hinterlegt waren, tatsächlich
B. subtilis
zuzuordnen
sind. Nach der Korrektur der Benennung dieser Spektren wurden auch alle Isolate von
B. subtilis
aus Bioplus 2B korrekt
identifiziert.
Bei den Isolaten aus dem Produkt Calsporin ergab sich bei der Identifizierung der FTIR-Spektren ein ambivalentes Bild. Der
Großteil der Organismen wurde korrekt als
B. subtilis
identifiziert, einige Isolate jedoch nicht. Für ihre Spektren ergab sich keine
eindeutige Identifizierung, sondern eine Mischung unterschiedlicher Arten wie
B. licheniformis
,
B. pumilus
und
B. atrophaeus
,
die alle relativ eng verwandt sind
.
Zudem wiesen diese Isolate eine sehr große Distanz zu den in der Datenbank vorhandenen
Spektren auf. Hier war also eine Anpassung der Datenbank mit Spektren von Isolaten aus Calsporin unbedingt erforderlich, um
eine korrekte Identifizierung zu gewährleisten. Insgesamt waren allerdings für die Sicherstellung einer zuverlässigen
Artidentifizierung probiotischer
Bacillus
-Stämme aus Futtermitteln nur kleine Adaptionen der Datenbank nötig, weil der
überwiegende Teil der Stämme bereits mit der bestehenden Datenbank sicher identifiziert wurde. Um dennoch das Spektrum
der Referenzdaten für
B. licheniformis
und
B. subtilis
zu erweitern, wurden zusätzlich neun Referenzstämme der Deutschen
Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) für
B. licheniformis
und acht für
B. subtilis
in die Datenbank integriert.
Nach Abschluss der Datenbankerweiterung wurde der letzte der vier bearbeiteten Futtermittelzusätze, GalliPro, untersucht. Hier
ergab die Identifizierung der FTIR-Spektren eine eindeutige Identifizierung als
B. subtilis
mit hohen Ähnlichkeiten zu den
Isolaten des Präparats Bioplus 2B.
Nach der
Identifizierung mit FTIR-Spektroskopie wurden aus den zur Verfügung stehenden Isolaten repräsentativ 18 Stück für
weiterführende Analysen ausgewählt. Darunter waren zwei Isolate von
B. licheniformis
sowie jeweils zwei Isolate der typischen
und atypischen
B. subtilis
-Form aus dem Bioplus 2B-Produkt, der
B. licheniformis
aus dem Produkt AlCare, drei Isolate der
typischen und zwei der atypischen
B. subtilis
-Form aus dem Calsporin-Produkt, und jeweils drei Isolate der typischen und
atypischen
B. subtilis
-Form aus GalliPro. Die Identifizierung aller Isolate als
B. licheniformis
bzw.
B. subtilis
konnte sowohl über
die Anwendung des API-Systems von bioMérieux als auch über 16S rDNA-Sequenzierung bestätigt werden.
3.1.3
Differenzierung und Identifizierung auf Stammebene
Neben der Artidentifizierung von Sporenbildnern aus Futtermitteln sollte eine Abgrenzung unterschiedlicher probiotischer
Stämme von Wildstämmen erarbeitet werden und weiterführend eine Differenzierung probiotischer Isolate auf Stammebene.
Zudem war die Frage zu klären, ob
B. subtilis
-Isolate unterschiedlicher Koloniemorphologie in unterschiedliche Stämme zu
differenzieren sind.

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Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 15
3.1.3.1 Charakterisierung mittels API
Zunächst wurde eine phänotypische Charakterisierung der probiotischen Isolate mit dem System API 50 CHB von bioMérieux
vorgenommen. Die
B. licheniformis
-Stämme aus den Präparaten AlCare und Bioplus 2B zeigten Unterschiede in der
Verwertung der drei Substrate Galactose, Sorbitol und Gluconat, wobei jeweils der Stamm aus AlCare eine positive und die
Stämme aus Bioplus eine negative Reaktion zeigten (Abbildung 7). Jedoch unterlagen die Ergebnisse mit dieser Methode
einigen
Schwankungen; so waren beispielsweise die Reaktionen für Galactose bei den Stämmen aus Bioplus nicht immer
einheitlich negativ, weil in einigen Tests hier doch eine Verwertung stattfand.
Abbildung 7: Vergleich der API 50 CHB-Profile für
B. licheniformis
aus AlCare und Bioplus 2B nach 48 h Inkubation
Die divergierenden Reaktionen sind schwarz umrandet.
Die
B. subtilis
-Isolate aus Bioplus 2B und GalliPro zeigten im API identische Verwertungsprofile und können somit über diese
Methode nicht differenziert werden. Gegenüber dem Stamm aus Calsporin ergaben sich jedoch bei drei Reaktionen
unterschiedliche Ergebnisse, die in Tabelle 2 zusammengestellt sind. Die Unterschiede
waren auch hier nicht immer eindeutig
und unterlagen vor allem im Fall von Turanose Schwankungen. Zu beachten ist, dass bei Verwendung des API-Systems die
Streifen sowohl nach 24 als auch nach 48 Stunden Inkubation auszuwerten sind, weil einige Substrate erst nach 48 Stunden
eine positive Reaktion zeigen, andere hingegen nach eindeutigem Indikatorumschlag nach 24 Stunden einen Tag später bereits
wieder realkalisiert sind.
Tabelle 2: Unterschiede der
B. subtilis
-Stämme aus Bioplus 2B, GalliPro und Calsporin in den API 50 CHB-Profilen
Substrat
Bioplus 2B/GalliPro
Calsporin
Sorbitol
-
+
Inulin
+
-
Turanose
+
(-)*
* Dieses Merkmal war nicht bei allen getesteten Isolaten stabil, sondern teilweise ergaben sich auch positive Reaktionen.
Zwischen den unterschiedlichen morphologischen Typen der
B. subtilis
-Stämme ergaben sich hingegen im API-Test keinerlei
reproduzierbare Abweichungen, was darauf schließen lässt, dass die Unterschiede in der Kolonieform nicht mit einer
abweichenden Verwertung gängiger Zucker einhergehen und die Morphotypen sich physiologisch sehr ähnlich sind. Allerdings
wurde für eines der beiden getesteten Isolate mit atypischer Morphologie aus Calsporin ein abweichendes Profil ermittelt.

Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 16
Dieses Isolat zeigte keine Verwertung von Inositol und Melibiose, wohingegen die übrigen vier untersuchten
B. subtilis
-Isolate
dieses Präparats hier eine positive Reaktion zeigen. Zwei weitere Isolate aus Calsporin, die zu einem anderen Zeitpunkt aus
diesem Futtermittelzusatz isoliert wurden, zeigten ebenfalls ein abweichendes Profil, allerdings lagen hier die Unterschiede bei
den Reaktionen Galactose und Turanose. Ob es sich hierbei um Artefakte oder systematische Unterschiede handelt, sollte über
den Einsatz molekularbiologischer Typisierungstechniken geklärt werden. In diesem Teil der Arbeit galt es ebenfalls zu
ermitteln, ob es sich bei den identischen API-Profilen der Isolate von Bioplus 2B und GalliPro um einen Zufall handelt oder ob
diese Stämme tatsächlich identisch sind.
Über den Einsatz des API 50 CHB-Systems von bioMérieux ist eine eindeutige Differenzierung der probiotischen Stämme aus
unterschiedlichen Produkten zumindest zum Teil möglich. Beeinträchtigt wird diese Art der Typisierung allerdings von der nicht
immer eindeutigen Indikatorreaktion der API-Streifen, deren Umschlag von Rot nach Gelb bei positiver Reaktion nicht selten bei
Orange endet und eine klare Interpretation der Ergebnisse erschwert. Auch ist das Ergebnis für das gleiche Substrat bei
mehrmals durchgeführten Tests nicht immer identisch, weil die Verwertung stoffwechselphysiologischen Schwankungen
unterliegt. Der Einsatz des API-Systems ist daher für eine zuverlässige Zuordnung von unbekannten Isolaten zu einem
bestimmten Futtermittelzusatz nicht geeignet.
3.1.3.2 Typisierung über RAPD
Für eine eindeutige Differenzierung auf Stammebene wird häufig auf molekularbiologische Methoden zurückgegriffen, weil
Merkmale auf der genomischen DNA stabil sind und nicht durch kultivierungsbedingte Schwankungen z. B. des Stoffwechsels
beeinflusst werden. Für die Bearbeitung des vorliegenden Problems wurde die Methode der randomly amplified polymorphic
DNA (RAPD) verwendet. Sie beruht auf der Analyse von DNA-Fragmentmustern, die über eine Vervielfältigung von DNA mit
unspezifischen Primern erhalten werden, deren Sequenz mehrfach im Genom vorkommt und deren Verteilung über das Genom
stammtypisch ist.
Weil diese Methode sehr sensitiv ist und deshalb Schwierigkeiten bei der Wiederholbarkeit auftreten können, wurde sie über die
vorherige Extraktion der genomischen DNA mittels eines kommerziellen Kits und den Einsatz einer definierten DNA-Menge in
der PCR standardisiert. Dieses Vorgehen erzielte eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und eine 100%-ige
Vergleichbarkeit von Mustern auch aus unterschiedlichen DNA-Extraktionen.
Abbildung 8 zeigt die Muster der zwölf Isolate aus Bioplus 2B, Calsporin
und AlCare, mit denen weiterführende Analysen
durchgeführt wurden. Es sind fünf deutlich unterschiedliche Fragmentmuster zu erkennen, wobei mit einer Ausnahme jeweils
Isolate der gleichen Art aus dem gleichen Präparat auch das gleiche Profil zeigen. So unterscheiden sich die
B. licheniformis
-
Isolate aus Bioplus 2B deutlich vom Isolat aus AlCare und die
B. subtilis
-Isolate aus Bioplus 2B von denen aus Calsporin.
Unterschiede bei
B. subtilis
nach Zugehörigkeit zu einem bestimmten Morphotyp sind allerdings nicht zu erkennen, weil für
beide Präparate jeweils Isolate des Morphotyps A und T identische Muster zeigen. In Kombination mit den Daten aus der API-
Analyse ist daraus zu schlussfolgern, dass die Ausprägung der Koloniemorphologie – zumindest nach den Ergebnissen dieser
beiden Methoden – nicht auf das Vorhandensein unterschiedlicher Stämme zurückzuführen ist, sondern andere Gründe haben
muss.

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Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 17
Abbildung 8: RAPD Fragmentmuster stellvertretender Isolate der Präparate Bioplus 2B, Calsporin und AlCare
Bahn 1 und 14: DNA-Marker, Bahn 2 und 3:
B. licheniformis
(Bioplus), Bahn 4 und 5:
B. subtilis
(atypisch, Bioplus),
Bahn 6 und 7:
B. subtilis
(typisch, Bioplus), Bahn 8-10:
B. subtilis
(typisch, Calsporin), Bahn 11 und 12:
B. subtilis
(atypisch, Calsporin), Bahn 13:
B. licheniformis
(AlCare)
Eine Ausnahme stellt jedoch ein Isolat aus Calsporin dar (Bahn 12 in Abbildung 8, das ein klar von den vier anderen Isolaten
dieses
Präparats abweichendes Muster aufweist und somit einen zweiten RAPD-Typ darstellt. Auch dieses Ergebnis ist in
Übereinstimmung mit der Charakterisierung über API, die für dieses Isolat ebenfalls Abweichungen ergab. Die Analyse weiterer
Isolate aus Calsporin ergab, dass noch drei andere Isolate diesen RAPD-Typ aufweisen, wobei zwei davon bereits über API
charakterisiert wurden und auch hier abweichende Profile zeigten. Weil diese Isolate zu einem späteren Zeitpunkt aus einer
neuen Probe des Präparats gewonnen wurden, kann es sich bei den Ergebnissen der RAPD- und API-Analysen also nicht um
zufällige Resultate z.B. durch eine Kontamination bei der Isolation der Organismen handeln. Vielmehr müssen beide RAPD-
Typen originär aus dem Futtermittelzusatz stammen.
Der Vergleich der Muster der
B. subtilis
-Stämme aus den Präparaten Bioplus 2B und GalliPro, die deckungsgleiche API-Profile
aufwiesen, ist in Abbildung 9 dargestellt. Alle Isolate zeigen exakt identische Muster und sind somit auch über die RAPD-
Analyse
nicht unterscheidbar.
Abbildung 9: RAPD-Fragmentmuster stellvertretender Isolate der Präparate Bioplus 2B und GalliPro
Bahn 1 und 10: DNA-Marker, Bahn 2 bis 5:
B. subtilis
Bioplus 2B, Bahn 6 bis 9:
B. subtilis
GalliPro

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Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 18
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass RAPD-PCR als Referenzmethode zur Typisierung von
Bacillus
-Isolaten gut
geeignet ist und reproduzierbare Ergebnisse liefert, eine Differenzierung der unterschiedlichen Morphotypen bei
B. subtilis
jedoch nicht möglich ist. Eine Übersicht über die für jeden Futtermittelzusatz differenzierten Stämme gibt Tabelle 3.
Tabelle
3: Übersicht über die Zahl der in den Futtermittelzusätzen enthaltenen Einzelstämme
Futtermittelzusatz
Enthaltene Spezies
Zahl der Einzelstämme (RAPD-Muster)
Bioplus 2B
B. licheniformis
B. subtilis
1
1*
Calsporin
B. subtilis
2
AlCare
B. licheniformis
1
GalliPro
B. subtilis
1*
* Diese beiden Muster sind identisch.
3.1.3.3 Typisierung und Identifizierung mittels FTIR-Spektroskopie
Sowohl für
B. licheniformis
als auch
B. subtilis
waren zwei unterschiedliche Stämme aus zwei unterschiedlichen probiotischen
Präparaten Gegenstand der Untersuchung, die sowohl über API als auch RAPD-Analysen klar differenziert werden konnten.
Zudem waren
B. subtilis
-Isolate aus zwei Futtermittelzusätzen zu prüfen, die sowohl über das API-System als auch die RAPD-
PCR nicht differenziert werden konnten und bei denen die Vermutung nahe liegt, dass sie identisch sind. Die zwei
unterschiedlichen morphologischen Varianten bei allen
B. subtilis
-Stämmen konnten mit keiner der genannten Methoden
differenziert werden; jedoch zeigten sich für einen geringen Teil der Isolate aus dem Präparat Calsporin reproduzierbare
Unterschiede, die belegen, dass es sich bei diesem Produkt um eine Mischung aus zwei Stämmen handeln muss.
Abbildung 10: Clusteranalyse der FTIR-Spektren für
B. licheniformis
aus AlCare und Bioplus 2B
Für die Berechnung wurde die 1. Ableitung der Spektren in den Bereichen 3000-2800 cm
-1
, 1800-1500 cm
-1
,
1500-1200 cm
-1
, 1200-900 cm
-1
und 900-700 cm
-1
herangezogen.

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Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 19
Eine Unterscheidung der Stämme von
B. licheniformis
und
B. subtilis
der Präparate Bioplus 2B, AlCare und Calsporin ist auch
über FTIR-Spektroskopie gut möglich. Abbildung 10 zeigt Spektren des Isolats aus AlCare (G5041) und zwei beispielhafter
Isolate
aus Bioplus 2B (G5005 und G5011). Alle drei Stämme zeigen eine gute Reproduzierbarkeit bei den
Wiederholungsmessungen und sind deutlich in zwei Cluster getrennt.
Abbildung 11: Clusteranalyse der FTIR-Spektren für
B. subtilis
aus Calsporin (rot und orange) und Bioplus 2B (blau)
Für die Berechnung wurde die 1. Ableitung der Spektren in den Bereichen 3000-2800 cm
-1
, 1800-1500 cm
-1
,
1500-1200 cm
-1
, 1200-900 cm
-1
und 900-700 cm
-1
herangezogen.
In Abbildung 11 ist eine Clusteranalyse für die
B. subtilis
-Stämme aus Bioplus 2B und Calsporin dargestellt. Für Bioplus wurden
jeweils zwei und für Calsporin einmal drei und einmal vier Isolate mit typischer und atypischer Morphologie verwendet
(bezeichnet mit A oder T). Die Spektren der Stämme beider Präparate sind eindeutig voneinander separiert und bestätigen
damit die Ergebnisse aus den API- und RAPD-Analysen. Auch eine Auftrennung der Spektren von Bioplus 2B nach Morphotyp
ist zu erkennen, auch wenn diese nicht vollständig ist, weil einige Spektren eines atypischen Isolats im Cluster der typischen
liegen. Hier liegt ein deutlicher Widerspruch zu den Ergebnissen aus API und RAPD, bei denen keinerlei diskriminierende

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Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 20
Merkmale detektiert werden konnten. Ein ähnliches Bild ergibt sich für Calsporin, wo die Spektren typischer und atypischer
Isolate ebenfalls fast vollständig separierte Cluster bilden. Bemerkenswert ist hier die außerordentlich große spektrale Distanz
von ca. 3,5, die zwischen den Clustern der typischen und der atypischen Form liegt und die um ca. das Dreifache über der
Distanz bei Bioplus 2B liegt.
Das Cluster der atypischen Isolate bei Calsporin ist zudem unterteilt in ein Subcluster für den RAPD-Typ 1 und eines für RAPD-
Typ 2; die API- und RAPD-Ergebnisse lassen sich also auch auf Basis von FTIR-Spektren reproduzieren. Auffallend ist
allerdings, dass die beiden Kolonie-Morphotypen, für die mit keiner anderen Methode Unterschiede zu ermitteln waren, über
ihre FTIR-Spektren sehr klar zu differenzieren sind, während sich die Spektren des zweiten RAPD-Typs nur mit einer im
Verhältnis dazu geringen Distanz von den restlichen Spektren der atypischen Form abgrenzen. Betrachtet man also die
gesamte biochemische Zusammensetzung der Zellen wie es über FTIR-Spektren möglich ist, ergeben sich für die
koloniemorphologischen Varianten eindeutige Unterschiede, die jedoch über die Bestimmung einzelner Charakteristika wie
Substratverwertung oder DNA-Profile nicht in Erscheinung treten.
Abbildung 12: Clusteranalyse der FTIR-Spektren für
B. subtilis
aus Calsporin und Bioplus 2B
Für die Berechnung wurde die 1. Ableitung der Spektren in den Bereichen 3030-2830 cm
-1
, 1350-1200 cm
-1
und
900-700 cm
-1
verwendet.
Die
B. subtilis
-Isolate aus Bioplus 2B und GalliPro waren über API und RAPD-PCR nicht zu unterscheiden und auch ihre FTIR-
Spektren weisen sehr hohe Ähnlichkeiten auf. Abbildung 12 zeigt eine Clusteranalyse von vier Stämmen aus Bioplus (jeweils
zwei der typischen und atypischen Koloniemorphologie) und fünf Stämmen aus GalliPro (drei der typischen und zwei der
atypischen Koloniemorphologie). Zu sehen ist nicht nur, dass Cluster von typischen und atypischen Isolaten abwechseln und in
diesem Fall also die beiden morphologischen Kolonievarianten nicht zu differenzieren sind, sondern auch, dass Cluster der
beiden unterschiedlichen Präparate alternieren und z. T. Spektren beider Zusätze in einem Subcluster vermischt sind. Die
Daten der FTIR-Spektroskopie bestätigen somit die Ergebnisse aus den vorhergehenden Analysen und lassen vermuten, dass
die Stämme aus beiden Futtermittelzusätzen identisch sind. Als Konsequenz wurden sie bei der Validierung der Datenbank
ebenfalls als identisch betrachtet.

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Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 21
Über eine Adaption der Referenzdatenbank mit Spektren der zur Verfügung stehenden probiotischen Stämme sollte eine
Differenzierung unbekannter Isolate in Wildstämme oder Probiotika und - wenn möglich - zudem eine Zuordnung zur typischen
oder atypischen Kolonievariante bei
B. subtilis
sichergestellt werden. Zu diesem Zweck wurden für jede Art sowie jeden
Kolonie- und RAPD-Typ Spektren als neue Referenzen in die Datenbank integriert. Die so entstandene neue Datenbank wurde
dann mit einem Teil der Isolate auf ihre Leistungsfähigkeit getestet.
Die Zuordnung der Spektren zu dem entsprechenden Futtermittelzusatz gelang in den meisten Fällen sehr eindeutig und zeigt,
dass die eingesetzten Stämme starke Unterschiede zu Umweltisolaten aufweisen und von diesen sehr gut zu differenzieren
sind. Allerdings fällt auf, dass sich immer wieder Spektren, die bereits vor Beginn dieses Projektes in der Datenbank vorhanden
waren, mit sehr geringen Distanzen in die Hitlisten mischen. Abbildung 13 zeigt beispielhaft solch eine Hitliste für ein Isolat mit
typischer
Kolonieform aus Bioplus 2B.
Abbildung 13: Hitliste für ein FTIR-Spektrum von
B. subtilis
aus Bioplus 2B
An den Positionen 4 und 8 steht ein Spektrum in der Hitliste, das bereits vor der Anpassung der Datenbank in dieser
enthalten war.
Für die vierte Position ist bereits an der Benennung zu erkennen, dass es sich hier um ein zu früherer Zeit in die Datenbank
integriertes Isolat aus Bioplus 2B handelt; an Position acht hingegen steht das Spektrum eines Isolats aus dem
Lebensmittelumfeld. Weil sich auch für die Stämme anderer Zusätze sowie für
B. licheniformis
ein ähnliches Bild ergab, sollte
geklärt werden, ob diese Umweltisolate tatsächlich Wildtypen darstellen, die sehr große Ähnlichkeiten zu den Probiotika
aufweisen, oder ob die Erklärung für die geringen Distanzen zwischen den Spektren darin liegt, dass es sich um den gleichen
Stamm handelt. Zu diesem Zweck wurden aus den Hitlisten einige Umweltisolate ausgewählt und für diese RAPD-Profile
erzeugt. Diese sind zusammen mit den Profilen der Futtermittelzusatzstämme als Referenzen in Abbildung 14 dargestellt.
Das linke
Bild zeigt Referenzen und Isolate von
B. subtilis
, rechts sind die Muster von
B. licheniformis
dargestellt. Wie im
Vergleich der Muster zu sehen ist, ergaben sich für vier Stämme, die bereits vor Adaption der Datenbank als Referenzen in
dieser enthalten waren, identische Profile zu Futtermittelzusatzstämmen aus sowohl Bioplus 2B als auch Calsporin (mit roten
Pfeilen markiert). Zwei Stämme entsprechen
B. subtilis
, ein Stamm
B. licheniformis
aus Bioplus 2B, und der vierte Stamm ist
identisch zu
B. subtilis
(RAPD-Typ 1) aus Calsporin. Alle anderen Isolate stellen Wildtypen dar. Somit ist klar, dass für
B. subtilis
aus beiden Präparaten bereits Isolate aus anderen Quellen Eingang in die Datenbank gefunden hatten und deren
Auftauchen mit kleinen Distanzen in den Hitlisten plausibel ist. Alle anderen Stämme weisen hingegen eine zufällige spektrale
Ähnlichkeit zu den Probiotika auf.

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Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 22
Abbildung 14: RAPD Fragmentmuster stellvertretender Isolate der Präparate Bioplus 2B, Calsporin und AlCare sowie
einiger bereits in der Datenbank enthaltener Stämme
Links:
B. subtilis
, rechts:
B. licheniformis
. Links: Bahn 1 und 13: DNA-Marker, Bahn 2-4:
B. subtilis
(Bioplus 2B), Bahn
5+6: Isolate aus der Datenbank, Bahn 7:
B. subtilis
(Calsporin, RAPD-Typ 1), Bahn 8+9: Isolate aus der Datenbank,
Bahn 10-12:
B. subtilis
(Calsporin, RAPD-Typ 2). Rechts: Bahn 1 und 8: DNA-Marker, Bahn 2:
B. licheniformis
(AlCare),
Bahn 3:
B. licheniformis
(Bioplus), Bahn 4-7: Isolate aus der Datenbank. Rote Pfeile markieren Stämme der Datenbank
mit identischen Mustern zu probiotischen Futtermittelzusätzen.
Die Zuverlässigkeit der Identifizierung und Typisierung unbekannter Stämme mit der adaptierten Datenbank wurde mit acht
B. licheniformis-
und 13
B. subtilis-
Isolaten aus Bioplus 2B, 26
B. subtilis-
Isolaten aus Calsporin sowie 40
B. subtilis-
Isolaten
aus GalliPro ermittelt, wobei für die Isolate aus Bioplus 2B vier, für die aus Calsporin drei und für die aus GalliPro sieben
Spektren pro Isolat zur Verfügung standen. Die Ergebnisse zeigen sehr deutlich, dass eine Identifizierung auf Stammebene,
also mit einer Zuordnung zu einem Futtermittelzusatz, für die Produkte Bioplus 2B, Calsporin und GalliPro mit 91 bis 100 %
korrekten Resultaten sehr gut funktioniert und eine ausgezeichnete Zuverlässigkeit bietet (Tabelle 4).
Tabelle 4: Zuverlässigkeit der angepassten FTIR-Referenzdatenbank für die Identifizierung von Stämmen aus Bioplus
2B, Calsporin und GalliPro auf Art- und Stammebene sowie für die Typisierung nach koloniemorphologischem und
RAPD-Typ in Prozent
Bioplus 2B
B. licheniformis
Bioplus 2B
B. subtilis
Calsporin
B. subtilis
GalliPro
B. subtilis
Artebene
100
100
96
100
Stammebene
91
95*
96
100*
Kolonietyp
--
nicht möglich
94
nicht möglich
RAPD-Typ
--
--
96
* Weil diese beiden Stämme nicht voneinander zu differenzieren waren, wurden sie bei der Auswertung als ein Stamm behandelt.
Eine Anpassung der bestehenden FTIR-Referenzdatenbank ist somit ausreichend, um eine Identifizierung von Sporenbildnern
aus Futtermitteln sicherzustellen. Eine Umstellung der Datenauswertung auf neuronale Netze ist daher nicht erforderlich. Für
Calsporin ist zudem eine ebenso zuverlässige Typisierung nach koloniemorphologischem Typ sowie RAPD-Typ möglich. Für
den
B. subtilis
-Stamm aus Bioplus 2B und GalliPro ist dies leider nicht der Fall, weil die spektralen Unterschiede zwischen
beiden morphologischen Varianten nicht so groß sind wie bei Calsporin (siehe Abbildung 11) und zudem je nach Art der
Datenauswertung
unterschiedlich zum Tragen kommen (siehe Abbildung 12), was dazu führt, dass sie nicht stabil genug sind,
um über
eine Datenbank-Identifizierung reproduzierbar gute Ergebnisse zu bringen. Dies ist bereits aus Abbildung 13

Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 23
ersichtlich, wo die ersten beiden Hits mit fast identischer Hitqualität aufeinander folgen, einer der beiden jedoch zur typischen,
der andere zur atypischen Form gehört.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit Ausnahme der Ähnlichkeiten zwischen
B. subtilis
aus GalliPro und Bioplus 2B
eine Typisierung der Isolate hinsichtlich ihrer Zugehörigkeit zu unterschiedlichen Futtermittelzusätzen über die Verwendung des
RAPD-Systems erfolgreich war und sich diese Methode deshalb hervorragend als Referenzmethode eignet. Eine Typisierung
der Isolate nach der koloniemorphologischen Form war jedoch nicht möglich. Hingegen zeigten sowohl die Ergebnisse der API-,
RAPD- und auch FTIR-Analysen, dass im Produkt Calsporin eindeutig zwei unterschiedliche Stämme vorliegen, von denen der
RAPD-Typ 1 jedoch mit ca. 90 % den Großteil der Isolate ausmacht. Die Identifizierung von Organismen aus
Futtermittelzusätzen auf Artebene war bereits vor Anpassung der Referenzdatenbank sehr zuverlässig und ist nach der
Adaption nahezu perfekt möglich. Auch die Zuordnung der Spektren zu den einzelnen Produkten zeigt mit 91 bis 100 % eine
sehr hohe Zuverlässigkeit. Für
B. subtilis
aus Bioplus 2B und Gallipro ist eine sichere Typisierung nach Koloniemorphologie
nicht möglich, wohingegen für die beiden Stämme aus Calsporin sowohl für die typische und atypische Form als auch die
beiden RAPD-Typen sehr gute Ergebnisse erzielt werden.
3.2 Milchsäurebakterien
3.2.1 Referenzstämme
Für die Identifizierung von Milchsäurebakterien existierten an der Abteilung Mikrobiologie bereits sowohl eine
Referenzdatenbank, die mit der OPUS-Software der Firma Bruker Optik (Ettlingen) erstellt wurde, als auch ein künstliches
neuronales Netz (KNN), das mit der Software ‚NeuroDeveloper
®
’ der Firma Synthon (Heidelberg) trainiert wurde. Die OPUS-
Datenbank enthält Spektren von 407 Stämmen, die zu 105 unterschiedlichen Arten gehören; das KNN 368 Stämme aus
92 Arten.
Gegenstand der Untersuchung waren probiotische Futtermittelzusätze in Form der drei Arten
Enterococcus faecium
,
Pediococcus acidilactici
und
Lactobacillus rhamnosus
. Von
E. faecium
standen 106 Isolate zur Verfügung, die fünf
unterschiedlichen Stämmen zugeordnet waren und aus unterschiedlichen Futtermitteln isoliert wurden. 24 Isolate waren Stamm
CECT 4515 zugeordnet, 20 Stamm DSM 3530, 29 Stamm DSM 7134, 13 Stamm NCIMB 10415 und 20 Stamm NCIMB 11181.
Der Stamm DSM 7134 war bereits mit einem Isolat als Referenz sowohl in der OPUS-Referenzdatenbank als auch dem KNN
enthalten. Für
P. acidilactici
standen 13 Isolate zur Verfügung, die alle dem Stamm CNCM MA 18/5M zugeordnet waren, und
die Art
L. rhamnosus
war mit drei Isolaten des Stammes DSM 7133 vertreten. Dieser Stamm war bereits sowohl in der OPUS-
Referenzdatenbank als auch dem KNN enthalten, die Art
P. acidilactici
war jedoch noch nicht Teil der Datenbanken und musste
deshalb neu integriert werden.
3.2.2 Identifizierung auf Artebene
Weil KNN auf einer Verarbeitung von Referenzdaten mit Hilfe multivariater Statistik beruhen und das vorhandene KNN
ausgebaut werden sollte, mussten von jedem Isolat ausreichend Spektren zur Verfügung stehen, um eine statistische
Auswertung zuzulassen. Aus diesem Grund wurden von jedem Isolat zehn unabhängige FTIR-Spektren aufgenommen. Weil
von
L. rhamnosus
nur drei Isolate zur Verfügung standen, wurden hier 25 Spektren aufgenommen, damit ausreichend Daten für
eine Abgrenzung zu ubiquitären Stämmen vorhanden waren.
Die Identifizierung von Milchsäurebakterien wird durch eine große Artenvielfalt erschwert. Bemerkenswert ist, dass obwohl
innerhalb mancher Gattungen große Unterschiede zwischen einzelnen Arten bestehen, Speziesgruppen existieren, innerhalb
derer es sehr enge Verwandtschaftsverhältnisse gibt. Aufgrund dieser Konstellation ist es mit der Identifizierung über OPUS-
Referenzdatenbanken nicht immer möglich, eine sichere Aussage auf Artebene treffen zu können. Deshalb wurde zusätzlich ein
Identifizierungssystem über KNN aufgebaut, das aufgrund der hierarchischen Strukturierung gerade in eng verwandten
Artgruppen eine bessere Auflösung bietet. Für dieses wurden nahezu alle enthaltenen Stämme über molekularbiologische
Methoden identifiziert, so dass über die Identität der Referenzstämme kein Zweifel besteht. Das KNN bestand vor der Adaption
aus 35 Einzelnetzen, die zu einem großen KNN mit sechs aufeinander folgenden Ebenen verknüpft waren (Abbildung 15), weil
die zuverlässige Trennung von 92 Arten in einem Schritt nicht möglich ist. Auf der ersten Ebene werden drei Klassen
differenziert. Klasse 1 enthält die Gattungen
Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus
und
Carnobacterium
, Klasse 2

image
image
Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 24
Lactobacillus
und
Pediococcus
und Klasse 3
Leuconostoc
,
Weissella
und
Oenococcus
. Diese Art der Aufteilung orientiert sich
an den über DNA-Vergleiche ermittelten Verwandtschaftsverhältnissen, die weitere Untergliederung wurde dann aber an den
spektralen Ähnlichkeiten ausgerichtet, da diese sich nicht immer mit den phylogenetischen Ähnlichkeiten decken. Eine
Ausnahme bildet hier die Gattung
Lactobacillus
, bei der versucht wurde, auf der zweiten Hierarchiestufe eine Gliederung nach
Art der Fermentation von Zuckern vorzunehmen, weil diesen Eigenschaften in der Lebensmittelmikrobiologie eine zentrale
Bedeutung zukommt. Insgesamt 19 verschiedene Arten der Gattung
Enterococcus
sind im KNN enthalten, für deren
Auftrennung drei Hierarchiestufen von Nöten waren.
L. rhamnosus
und die zwei enthaltenen
Pediococcus
-Arten sind der
mittleren Klasse der Laktobazillen (fakultativ heterofermentativ) zugeordnet, für deren Identifizierung insgesamt fünf
Hierarchiestufen nötig waren. Das hier dargestellte KNN wurde mit 86 Stämmen aus Lebensmitteln auf seine Zuverlässigkeit
geprüft und erzielte mit 92,5 % korrekt identifizierten Spektren ein sehr gutes Resultat.
Abbildung 15: Architektur des KNN zur Identifizierung von Milchsäurebakterien vor der Erweiterung
35 Einzelnetze sind auf sechs Ebenen zu einem Gesamtnetz verknüpft. Aus Platzgründen wird in der Abbildung meist
auf die Darstellung der jeweils letzten Ebene verzichtet. Wo nicht anders gekennzeichnet entspricht diese der
Aufschlüsselung der zuletzt dargestellten Klasse in die einzelnen Arten.
Die Identifizierung der fünf probiotischen
E. faecium
-Stämme über das KNN ergab, dass die drei Stämme DSM 7134, NCIMB
10415 und NCIMB 11181 auf Artebene mit hoher Zuverlässigkeit identifiziert werden, die zwei Stämme CECT 4515 und DSM
3530 hingegen nicht. Das KNN musste an dieser Stelle also um diese Stämme erweitert werden, um eine sichere Identifizierung
auf Artebene zu gewährleisten. Die Identifizierung der
E. faecium
-Isolate über die OPUS-Datenbank ergab für keinen Stamm
durchgehend eindeutige Ergebnisse, sondern resultierte häufig in heterogenen Hitlisten, in denen Stämme unterschiedlicher
Enterococcus
-Arten alternierten. Hier zeigte sich bereits, dass die Identifizierung über KNN der durch die OPUS-Datenbank
überlegen ist, da die Kalibrierung über das Training der KNN die Differenzierung der eng verwandten
Enterococcus
-Arten
verbessert. Der
L. rhamnosus
-Stamm konnte über das KNN zuverlässig identifiziert werden, die Isolate von
P. acidilactici

image
Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 25
hingegen nicht, weil diese Art in beiden Datenbanken noch nicht enthalten war. Über die OPUS-Datenbank kann auch
L. rhamnosus
nicht sicher identifiziert werden, weil eine hohe Ähnlichkeit zu
L. casei
besteht.
Das KNN wurde somit zunächst um die probiotischen
E. faecium
-Stämme und
P. acidilactici
erweitert, damit auf Artebene eine
zuverlässige Identifizierung erzielt wird. Für jeden Stamm wurden die Spektren eines Isolats zum Training verwendet. Eine
Ausnahme stellen die Stämme CECT 4515 und DSM 3530 dar, von denen jeweils zwei Isolate verwendet wurden. In diesem
Rahmen wurden zudem einige weitere ubiquitäre
E. faecium
-Stämme in das KNN aufgenommen. Die Erweiterung führte dazu,
dass die Architektur des KNN leicht verändert werden musste, da für die Trennung der Arten um
E. faecium
und die
Pediokokken jeweils eine weitere Ebene nötig wurde (Abbildung 16, rot umrandet).
Abbildung 16: Architektur des KNN zur Identifizierung von Milchsäurebakterien nach der Erweiterung mit neuen
Stämmen der Arten
E. faecium
und
P. acidilactici
Die Erweiterung führte zu einer Änderung der hierarchischen Struktur, weil für die Trennung der Arten um
E. faecium
und die Pediokokken jeweils eine weitere Ebene nötig wurde (rote Umrandung). Aus Platzgründen wird in der
Abbildung meist auf die Darstellung der jeweils letzten Ebene verzichtet. Wo nicht anders gekennzeichnet, entspricht
diese der Aufschlüsselung der zuletzt dargestellten Klasse in die einzelnen Arten.
Nach der Erweiterung wurden alle nicht für das Training verwendeten Isolate genutzt, um die Genauigkeit des KNN zu ermitteln.
Für
L. rhamnosus
und
P. acidilactici
konnten 100 % korrekt identifizierte Spektren erreicht werden, bei den fünf
E. faecium
-
Stämmen lagen die Werte zwischen 96,6 und 99,4 % (Tabelle 5). Die Identifizierung auf Artebene
mit dem entwickelten KNN
hat somit einen hohen Grad an Zuverlässigkeit und ist eine sehr gute Ausgangsbasis für die Differenzierung ubiquitärer und
probiotischer Isolate.

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Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 26
Tabelle 5: Identifizierung der fünf probiotischen
E. faecium
-Stämme auf Artebene
CECT 4515
DSM 3530
DSM 7134
NCIMB 10415
NCIMB 11181
% korrekte
Identifizierung
99,1
97,3
99,4
99,2
96,6
3.2.3
Differenzierung und Identifizierung auf Stammebene
Im Anschluss an die Erweiterung der Datenbanken für die Speziesidentifizierung erfolgte die Kalibrierung der Systeme für die
Differenzierung probiotischer und ubiquitärer Stämme der Arten
E. faecium
und
L. rhamnosus
, wobei im Falle von
E. faecium
zusätzlich die fünf unterschiedlichen Futtermittelzusätze auch von einander unterschieden werden sollten. Weil für
P. acidilactici
keine ubiquitären Isolate zur Verfügung standen, ist hier nur die Artidentifizierung möglich.
3.2.3.1 Charakterisierung mittels API
Die Charakterisierung der probiotischen Milchsäurebakterien über das System API 50 CHL von bioMérieux ergab die in
Abbildung 17 dargestellten Profile. Untersucht wurden jeweils zwei
Isolate pro Stamm im Doppelansatz, mit Ausnahme von
Stamm CECT 4515, für den drei Isolate und Stamm DSM 7133, für den nur ein Isolat untersucht wurden.
Abbildung 17: API 50 CHL Profile der probiotischen Milchsäurebakterien sowie der beiden offiziellen
L. rhamnosus
-
Stämme DSM 20021 (T = Typstamm) und DSM 20177
Die Nummerierung der ersten Zeile bezieht sich auf die verwendeten Substrate, angegeben sind nur positive
Reaktionen. Unterschiede zwischen einzelnen Stämmen einer Art sind rot markiert.
Klar erkennbar ist die relativ große Ähnlichkeit zwischen den einzelnen Stämmen von
E. faecium
, bei denen sich nur die beiden
Stämme der DSM eindeutig von den übrigen drei differenzieren lassen. Stamm DSM 3530 zeigt bei den Substraten Amygdalin,
Melibiose, Saccharose und D-Tagatose (Nummern 23, 30, 31 und 42) eine negative Reaktion, wohingegen diese Substanzen
von den anderen vier Stämmen verstoffwechselt werden können. Bei Stamm DSM 7134 sind es immerhin noch die Substrate
α-Methyl-D-Mannosit und D-Raffinose (Nummern 20 und 35), die verstoffwechselt werden, von den übrigen vier Stämmen
jedoch nicht verwertet werden können. Die Stämme CECT 4515, NCIMB 10415 und NCIMB 11181 sind in ihren Reaktionen
identisch und können somit mit dem API-System nicht voneinander getrennt werden. Um für diese Probiotika Kriterien für eine
eindeutige Zuordnung einzelner Isolate zu den jeweiligen Stämmen zu erhalten, muss auf molekularbiologische Methoden
zurückgegriffen werden. Zudem ergeben sich, wie schon bei der Charakterisierung der Bazillen bemerkt, bei der mehrfachen

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Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 27
Analyse des gleichen Isolats nicht absolut übereinstimmende Profile, da die Verwertung mancher Substrate schwankt. Dies
konnte für Isolate aller drei Arten beobachtet werden und schränkt die Zuverlässigkeit des API-Systems zusätzlich ein.
Die Profile der Stämme
L. rhamnosus
DSM 20021T und DSM 20177 sind im Vergleich zum probiotischen Stamm DSM 7133
dargestellt, weil sich für diese Stämme auch über die FTIR-Spektroskopie Schwierigkeiten in der Abgrenzung ergaben.
3.2.3.2 Typisierung über RAPD
Ebenso wie für die Bazillen sollte eine robuste und eindeutige Differenzierung der Probiotika über den Einsatz von RAPD-PCR
erfolgen. Hierzu wurden die zwei Primersysteme ERIC2 und M13 getestet. Angewandt wurden sie jedoch nur auf
E. faecium
-
Isolate, weil es nur hier unterschiedliche Stämme zu differenzieren galt. Im Gegensatz zur Analyse der Bazillen über RAPD-
PCR war die Anwendung der Methode bei den Enterokokken mit mehr Schwierigkeiten behaftet. So wurde zwischen den
Profilen unterschiedlicher Ansätze vor allem bei der Zahl der detektierten Banden eine Varianz festgestellt, die die
Reproduzierbarkeit in einem gewissen Rahmen einschränkte; für die Hauptbanden war die Reproduzierbarkeit jedoch gegeben.
Abbildung 18 zeigt exemplarisch die Bandenmuster von zwei bis drei
Isolaten aller fünf Stämme, die über die Verwendung des
Primers ERIC2 erzielt wurden, sowie die Muster für die Stämme CECT 4515, NCIMB 10415 und NCIMB 11181, die mit dem
M13-Primer erzeugt wurden. Auch hier sind, analog zum API-System, nur für die Stämme DSM 3530 und DSM 7134
spezifische Bandenmuster zu erkennen, wobei Stamm DSM 3530 (S2) ein sehr markantes und klar zu differenzierendes Profil
aufweist, Stamm 7134 (S3) sich hingegen nur durch die Abwesenheit einer Bande und die Anwesenheit einer schwächeren
Bande abhebt (rot umrandet).
Auch der zweite Primer (M13) ergab für die Stämme CECT 4515, NCIMB 10415 und NCIMB 11181 identische Muster, was den
Schluss nahe legt, dass es sich um sehr ähnliche Stämme handeln muss, deren Unterschiede mit den hier angewandten
Methoden nicht offensichtlich werden. Für den Einsatz weiterer Primer fehlte im vorliegenden Projekt jedoch die Zeit.
Abbildung 18: RAPD Fragmentmuster stellvertretender Isolate der
E. faecium
-Stämme
CECT 4515 (S1), DSM 3530 (S2), DSM 7134 (S3), NCIMB 10415 (S4) und NCIMB 11181 (S5). Links: Primer ERIC2, rechts:
Primer M13. Rot umrandet ist der Bereich, in dem sich Stamm DSM 7134 von den übrigen vier Stämmen unterscheidet.
3.2.3.3 Typisierung und Identifizierung mittels FTIR-Spektroskopie
Weil für eine zuverlässige Artidentifizierung der Milchsäurebakterien das KNN genutzt wird, ist es notwendig und liegt nahe,
auch die Differenzierung der probiotischen und ubiquitären Isolate über ein KNN zu erzielen. Eine wesentliche Voraussetzung
für eine erfolgreiche Differenzierung ist die Architektur des KNN, d. h. die Aufteilung der Daten in einzelne Klassen, die auf der
jeweiligen Ebene unterschieden werden sollen.
Eine Trennung aller fünf
E. faecium
-Stämme war über API und RAPD-PCR nicht möglich, weil die drei Stämme CECT 4515,
NCIMB 10415 und NCIMB 11181 mit jedem System identische Profile aufwiesen. Mit FTIR-Spektroskopie jedoch konnten die
Stämme in vier Cluster unterteilt werden, wobei nur die beiden NCIMB-Stämme zusammen in ein Cluster fielen (Abbildung 19),
die anderen
Probiotika jedoch klar differenziert werden konnten. Analog zu den API- und RAPD-Analysen zeigte Stamm DSM
3530 auch hier die größten Distanzen zu den anderen Stämmen. Das Cluster der NCIMB-Isolate weist in Abb. 19 zwar eine
Trennung in zwei Subcluster auf, jedoch liegen in jedem der Subcluster Spektren beider Stämme.

image
Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 28
Eine genauere Analyse der Spektren dieser beiden Stämme im Vergeich zu zwei gut zu differenzierenden Stämmen (Abbildung
20) zeigt,
dass die Spektren absolut deckungsgleich sind und keine reproduzierbaren Unterschiede aufweisen. Somit ist klar,
dass die beiden NCIMB-Stämme mit keiner der zur Verfügung stehenden Methoden differenziert werden können und damit
auch im KNN in einer Klasse liegen müssen.
Abbildung 19: Clusteranalyse der FTIR-Spektren für die fünf probiotischen
E. faecium
-Stämme
Für die Berechnung wurde die 1. Ableitung der Spektren in den Bereichen 3030-2830 cm
-1
, 1800-1500 cm
-1
,
1500-1200 cm
-1
, 1200-900 cm
-1
und 900-700 cm
-1
verwendet.

image
Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 29
Abbildung 20: Vergleich der ersten Ableitungen von FTIR-Spektren vier probiotischer E. faecium-Isolate
CECT 4515 (blau) und DSM 3530 (rot) im oberen Teil zeigen deutliche Unterschiede, NCIMB 10415 (blau) und NCIMB
11181 (rot) sind deckungsgleich. Für jeden Stamm sind zehn Spektren im Bereich von 1450-700 cm
-1
gezeigt. Die
Ableitungen wurden vektornormalisiert.
Tabelle 6 gibt einen Überblick über die für das Training und die Validierung des KNN verwendeten
E. faecium
-Stämme. Ca. 80
% der zur Verfügung stehenden Isolate wurden für das Training eingesetzt, die übrigen 20 % dienten der Validierung des KNN
und somit der Überprüfung der Zuverlässigkeit.
Tabelle 6: Zahl der
E. faecium
-Isolate, die zum Training und zur Validierung des KNN zur Differenzierung ubiquitärer
von probiotischen Stämmen eingesetzt wurden
Training
Validierung
Gesamt
CECT 4515
19
5
24
DSM 3530
16
4
20
DSM 7134
22
5
27
NCIMB 10415
10
3
13
NCIMB 11181
16
4
20
Ubiquitär
11
3
14
Zwei Isolate des Stammes DSM 7134 wurden aus der Analyse ausgeschlossen, weil sie in der Clusteranalyse abseits des
ihnen zugehörigen Clusters gruppierten und somit ihre Identität nicht gesichert war. Weil allerdings für Stamm DSM 7134 die
meisten Isolate zur Verfügung standen, beeinträchtigte dies das Training nicht. Ubiquitäre Stämme standen insgesamt 14 zur
Verfügung, die aus unterschiedlichen Quellen (meist Lebensmitteln) isoliert wurden. Als optimale Architektur des KNN hat sich
die in Abbildung 21 dargestellte Struktur herausgestellt.
Zunächst wird auf der ersten Ebene zwischen ubiquitären und
probiotischen Stämmen unterschieden und anschließend auf der zweiten und dritten Ebene die Differenzierung der einzelnen
Probiotika vorgenommen. Dabei werden die Stämme CECT 4515, NCIMB 10415 und NCIMB 11181 auf Ebene zwei zunächst
in einer Klasse zusammengefasst und erst auf Ebene drei der Stamm CECT 4515 abgetrennt.

image
image
Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 30
Die Validierung des KNN mit den nicht für das Training verwendeten Isolaten ergab für die erste Ebene (Differenzierung von
probiotisch und ubiquitär) ein perfektes Ergebnis mit einer Quote von 100 % korrekt identifizierten Spektren und auch die
Differenzierung der probiotischen Stämme ergab mit 98,2 % richtig zugeordneten Spektren ein exzellentes Ergebnis. Somit ist
nicht nur die Differenzierung von probiotischen und ubiquitären Stämmen mit äußerster Zuverlässigkeit möglich, sondern auch
die einzelnen Probiotika können mit Ausnahme der NCIMB-Stämme sicher voneinander getrennt werden. Einschränkend muss
jedoch erwähnt werden, dass keine ubiquitären Isolate aus dem Futtermittelbereich zur Verfügung standen, weshalb die
Ergebnisse des KNN während der ersten Zeit des Einsatzes in der Futtermittelmikrobiologie noch kritisch betrachtet werden
sollten.
Abbildung 21: Architektur des KNN zur Differenzierung von probiotischen und ubiquitären
E. faecium
-Stämmen
Die Differenzierung der ubiquitären und probiotischen
L. rhamnosus
-Stämme war weniger komplex, weil nur ein probiotischer
L. rhamnosus
-Stamm Gegenstand der Untersuchung war, von dem auch nur drei Isolate zur Verfügung standen. Zwei der
Isolate wurden für das Training des KNN genutzt, der dritte für die Validierung. Zudem waren fünf ubiquitäre Stämme
vorhanden sowie zwei weitere Stämme der DSMZ.
Abbildung 22 zeigt eine hierarchische Clusteranalyse der ubiquitären und aller DSM-Stämme und es fällt auf, dass die zwei
offiziellen Stämme der DSM nicht von dem probiotischen Stamm differenziert werden können, die ubiquitären Isolate sich
dagegen deutlich abgrenzen. Auch über das API-System konnten zwischen dem probiotischen und den zwei anderen DSM-
Stämmen keine Unterschiede festgestellt werden (vgl. Abbildung 17), sodass auf jeden Fall davon ausgegangen werden kann,
dass diese
drei Stämme sehr ähnlich, wenn nicht gar identisch sind.
Abbildung 22: Clusteranalyse der FTIR-Spektren für den probiotischen
L. rhamnosus
-Stamm DSM 7133 sowie
ubiquitäre Stämme und zwei weitere Stämme der DSM
Für die Berechnung wurde die 1. Ableitung der Spektren in den Bereichen 3030-2830 cm
-1
, 1800-1500 cm
-1
,
1500-1200 cm
-1
, 1200-900 cm
-1
und 900-700 cm
-1
verwendet.
Für das Training des KNN wurden somit vier der fünf ubiquitären Isolate und zwei der drei probiotischen Isolate verwendet;
jeweils ein Stamm wurde für eine anschließende Validierung zurückgehalten. Die Stämme DSM 20021 und DSM 20177 wurden
aus der Analyse herausgehalten. Das KNN besteht nur aus einer einzigen Ebene, auf der die Trennung zwischen ubiquitär und
probiotisch erfolgt. Die Validierung mit 21 Spektren der zwei zurückgehaltenen Stämme ergab eine zu 100 % korrekte
Zuordnung zu den Klassen probiotisch und ubiquitär. Eine Differenzierung ubiquitärer Stämme vom probiotischen
L. rhamnosus

Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 31
ist somit mit hoher Zuverlässigkeit möglich. Auch hier muss jedoch darauf hingewiesen werden, dass keine ubiquitären Stämme
aus Futtermitteln zur Verfügung standen, weshalb das KNN für diesen Anwendungsbereich noch zu testen ist.
Zusammenfassend kann für die Milchsäurebakterien festgestellt werden, dass weder die Differenzierung über API noch über
RAPD-PCR zufriedenstellend war, weil mit beiden Systemen nur zwei der fünf
E. faecium
-Stämme zuverlässig abgegrenzt
werden konnten. Zudem zeigten beide Methoden keine gute Reproduzierbarkeit. Prinzipiell wäre es zwar möglich, dass über
den Einsatz anderer Primer in der RAPD-PCR bessere Ergebnisse zu erzielen wären, aus Zeitgründen war eine Anwendung
weiterer Primer allerdings nicht durchführbar. Die Identifizierung aller drei probiotischen Arten über FTIR-Spektroskopie und
KNN wurde mit hoher Zuverlässigkeit realisiert und auch die Differenzierung der probiotischen und ubiquitären Stämme von
E. faecium
und
L. rhamnosus
gelang mit einer Genauigkeit von 100 %. Auch war bei den Enterokokken die Differenzierung der
probiotischen Stämme untereinander mit Ausnahme der beiden NCIMB-Stämme gut möglich. Es steht somit ein System zur
Verfügung, mit dem sich Milchsäurebakterien aus Futtermitteln einfach, schnell und günstig bis unter die Speziesebene
analysieren lassen.
4 Fazit
FTIR-Spektroskopie hat sich als sehr leistungsstarke und zuverlässige Methode für die Differenzierung probiotischer
Sporenbildner und Milchsäurebakterien erwiesen. Für beide Organismengruppen wurden Identifizierungsraten zwischen 91 und
100 % in der Stammtypisierung erreicht, was nicht nur eine sichere Differenzierung von probiotischen und ubiquitären Isolaten
bedeutet, sondern auch die Differenzierung einzelner probiotischer Stämme der gleichen Art einschließt. Somit steht der
Futtermittelanalytik eine Methode zur Verfügung, mit der sich ohne großen Aufwand und mit hoher Zuverlässigkeit
mikrobiologische Stammanalysen durchführen lassen.
Die Technik ist einfach anzuwenden und lässt sich sehr gut in den Ablauf eines Labors integrieren. Weil sie verschwindend
geringe laufende Kosten verursacht und über einen hohen Automatisierungsgrad verfügt, können auch größere Probenmengen
gut bearbeitet werden. Zudem kann mit nur einer Analyse sowohl die Spezies bestimmt als auch unterhalb der Artgrenze
typisiert werden, was bislang mit keiner anderen Technik möglich ist. Die verwendeten Referenzdatenbanken sind offene
Systeme und können jederzeit mit weiteren Isolaten und Arten erweitert werden, was eine kontinuierliche Weiterentwicklung der
Technik ermöglicht.

Schriftenreihe des LfULG, Heft 26/2011 | 32
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Herausgeber:
Sächsisches Landesamt für Umwelt, Landwirtschaft und Geologie
Pillnitzer Platz 3, 01326 Dresden
Telefon: + 49 351 2612-0
Telefax: + 49 351 2612-1099
E-Mail: lfulg@smul.sachsen.de
www.smul.sachsen.de/lfulg
Autoren:
Dr. Mareike Wenning; Prof. Dr. Siegfried Scherer
Technische Universität München, Zentralinstitut für Ernährungs- und
Lebensmittelforschung, Abteilung Mikrobiologie
Telefon: + 49 8161 71 75 70
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Dr. Henriette Mietke-Hofmann
Staatliche Betriebsgesellschaft für Umwelt und Landwirtschaft, Geschäftsbereich
Labore Landwirtschaft
Redaktion:
Dr. Henriette Mietke-Hofmann
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Redaktionsschluss:
15.07.2011
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1867-2868
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